Молекулярно-генетические исследования: способы их проведения и виды

В основе этих методов лежат манипуляции с ДНК и РНК. Это сложные методы диагностики, требуют определённых лабораторных условий и подготовки квалифицированного персонала. Первый этап всех методов – получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют каплю крови, лейкоциты, культуры фибробластов, соскоб эпителия со слизистой оболочки, волосяные луковицы. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных вариантов и может долго сохраняться в замороженном состоянии.

Следующий этап молекулярно-генетической диагностики является рестрикция ДНК на фрагменты. Косвенная ДНК-диагностика в основном сводится к анализу полиморфных генетических маркеров. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких аллельных вариантах (по составу нуклеотодов, числу нуклеотидных поворотов).

В 1995 году в США рецессивными носителями мутации были признаны 15% племенных быков и 6% коров. Число носителей мутантного аллеля на Украине составляло 3,3%, в Германии – до 30%.

Для диагностики стресс-синдрома у свиней (ССС) использовался галотановый тест, молекулярно-генетический контроль стресс-чувствительности.

В селекционно-племенной работе широко используют Метод генетических маркеров. Методом ПЦР в пробе крови или спермы возможно выявление ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота. Анализ ДНК позволяет обнаружить животных, устойчивых к лейкозу.

В последние годы интенсивно ведутся исследования по использованию групп крови для раннего прогнозирования продуктивности животных и выявления различных аномалий.

Генетическое совершенствование продуктивности животных привело к распространению генетических аномалий. Как указывают Н. Г. Букаров, Е. Ю. Лебедев и др.

(2005) в соответствии с названным документом, генетические аномалии у крупного рогатого скота выявляются осмотром и цитогенетическим ДНК-анализом.

Например, если бык носитель CVM мутации (генотип cvTV) спаривают с коровой (тёлкой) не носителем мутагенного гена (TV TV), то в потомстве 50% животных будут носителями CVM, а 50% не носителями.

Она характеризуется предрасположенностью животных к инфекционным и неинфекционным заболеваниям. Методы ДНК-диагностики используют для выявления гена рецептора E.

Coli F18 (EC R F18), предопределяющего предрасположенность новорожденных поросят к колибактериозу).

Таким образом, в борьбе с неинфекционными и инфекционными болезнями продуктивных животных важную роль отводят генетическому отбору производителей. Обычно для этого используют блот-гибридизацию либо амплификацию с последующим анализом полученных образцов ДНК при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях или радиоавтографии.

Области медицинского применения методов молекулярной диагностики

Основной недостаток прямых методов состоит в том, что для их применения требуется знание точной локализации патологического гена в геноме, его экзон-ин-тронной структуры и спектра его мутаций. В зависимости от объема спектра мутаций в определенном гене, эта информативность может широко варьировать. Часть семей в этом случае остается не информативной для диагностики.

Разновидности методов ДНК-диагностики

Таким образом, основной недостаток косвенных методов заключается в их не 100%-ной точности. Вообще, точный расчет генетического риска при проведении косвенной диагностики представляет собой довольно сложную математическую задачу.

Кроме того, косвенные методы ДНК-диагностики могут быть применены только для монолокусных заболеваний и неэффективны для моногенных по-лилокусных болезней.

Действительно, для таких заболеваний существует несколько локусов, в которых необходимо проводить сегрегационный анализ и не ясно, какой из локусов выбрать.

Супруги могут получить сведения об их генетическом статусе в отношении наследственной болезни у ребёнка до планирования деторождения.

Проверка индивидуальной чувствительности к лекарствам молекулярно-генетическими методами должна стать стандартной процедурой перед лечением.

Необходимость идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел стимулировала использование современных молекулярно-генетических методов в судебнокриминалистической практике.

В США и Великобритании были разработаны и внедрены автоматические приборы по секвенированию геномов. Во-вторых, лабораторные методы позволяют регистрировать первичный продукт гена.

Для этого используются биохимические и иммунологические методы.

Следовательно, на этой ступени можно применять биохимические, иммунологические и цитологические методы, что и нашло подтверждение в клинической практике.

Ацидоз у детей в основном имеет те же причины и клинические признаки, что и у взрослых. Молекулярная диагностика — значительный шаг к персонализированной медицине, она позволяет учитывать все особенности конкретного пациента при обследовании и терапии.

Где можно пройти молекулярную диагностику заболеваний?

Молекулярная диагностика помогает выявить у взрослых и детей опасность в будущем подвергнуться различным патологиям.

Нужно отметить, что есть болезни, которые вызваны исключительно мутацией гена (моногенные) и те, которые обусловлены в том числе генетическими особенностями (мультифакторные).

Как уже было сказано, молекулярная диагностика способна дать информацию о состоянии здоровья и генетических предрасположенностях человека.

Молекулярно-генетическое исследование в лечении бесплодия

Благодаря новым исследованиям в области генетики перед ранее бездетными парами открылись новые перспективы решения их сложных проблем.

Потенциальные родители не просто хотят иметь детей, они готовы приложить максимум усилий к тому, чтобы их дети были здоровы, умны и социально благополучны

. И здесь неоценимую роль играют новейшие достижения генетики, которые могут не только помочь будущим родителям успешно решить проблемы, связанные с бесплодием, но и передать своему потомству полноценный генетический материал.

Молекулярно-генетическое исследование: что это

При проведении молекулярно-генетического исследования досконально изучаются строение и целостность хромосом и генов, отвечающих за определенные свойства организма не только в период внутриутробного развития человека, но и в течение всей его жизни (например, болезнь Бехтерева начинает развиваться у мужчин старше 20-30 лет, а многие онкологические заболевания – после 40-50 лет).

Молекулярно-генетическое исследование способно выявить наличие отклонений в строении, положении хромосом и генов, их комплектности (они не изменены, но их может быть больше или меньше, что уже ведет к возникновению грубой наследственной патологии).

Молекулярно-генетическое исследование позволяет:

• понять причины развития тех или иных отклонений в состоянии здоровья;
• прогнозировать развитие патологии и степень вероятности передачи ее по наследству;
• выработать соответствующие лечебно-профилактические мероприятия.

Для проведения исследования у пациентов берут кровь из вены.

В среднем срок выполнения исследования составляет две недели. Каждый вид молекулярно-генетического исследования проводится один раз в течение жизни.

Показания к проведению молекулярно-генетического исследования

• Выраженная патология спермы (патозооспермия, олигозооспермия и аспермия – неполноценные по строению сперматозоиды, недостаточное их количество и активность).
• Два и более выкидыша или случая мертворожденности (без явной причины или с наличием аномалий развития внутренних органов у плода).
• Врожденные аномалии развития или другие наследственные нарушения у родившихся детей (если речь идет о вторичном бесплодии), а также у супругов или их родственников.
• Близкородственный брак (не только между супругами, но и их родителями).
• Бесплодный брак у других родственников.

Практическое использование молекулярно-генетических исследований

После взятия генетического материала и его досконального изучения врачи-генетики могут:

• дать объективную картину наличия (или отсутствия) генетических (хромосомных и генных) изменений и вероятности наследования их потомством;
• в случае, если возможна коррекция (например, вследствие бытовых токсических воздействий на репродуктивный аппарат или при заболеваниях, требующих оперативного лечения), провести полноценную комплексную терапию обоих или одного из супругов;
• при выявлении серьезной генетической патологии, не поддающейся коррекции и сопровождающейся бесплодием, не прибегать к длительному и заведомо неэффективному многолетнему лечению одного или обоих супругов, а планировать решение проблемы бесплодия с помощью новейших методов вспомогательной репродуктивной технологии (ЭКО, ИКСИ, суррогатное материнство и т.д.);
• провести предымплантационную генетическую диагностику плода, которая позволит оптимизировать сам процесс имплантации, уменьшить риск самопроизвольных абортов, патологического протекания беременности, а также предупредить рождение ребенка с наследуемой патологией;
• выявить наследственную предрасположенность к определенным заболеваниям и дать соответствующие рекомендации по их предупреждению.

Преимущества современных молекулярно-генетических методов

Молекулярно-генетические методы имеют дело в основном с молекулами ДНК и белков. Эти молекулы не так изменчивы, как морфологические признаки.

Кроме того, изменчивость морфологических признаков может быть интерпретирована значительно шире.

Например, можно спорить, какой из морфологических признаков является более важным — форма уха или длина рогов. А вот с важностью рибосомальной РНК споров не возникает.

Сравнивая ДНК и белки различных организмов, можно воспроизводить их эволюцию в прошлом, даже если не осталось ископаемых остатков для исследований.

Разнообразие современных молекулярно-генетических методов

Современные молекулярно-генетические методы можно условно разделить на несколько групп. Это методы выделения и очистки биологических молекул, методы амплификации (копирования) ДНК, методы гибридизации, анализ данных и моделирование. Обычно все методы исследований используются в комплексе.

Некоторые группы методов молекулярно-генетических исследований

Современные молекулярно-генетические методы имеют существенные преимущества перед традиционными методами исследований. Они предоставляют намного большие возможности для исследований и повышения надежности результатов. К таким методам относятся методы выделения нужных молекул из образцов тканей, методы амплификации ДНК, методы гибридизации, анализ информации и т. д.

Молекулярно-генетические методы исследования и их медицинское приложение

Молекулярно-цитогенетические методы. Методы флюоресцентной гибритизации FISH. Для этого метода требуется наличие ДНК – зондов. ДНК –зонд –одноцепочный фрагмент ДНК, длиной до 30 нуклеотидов и известного нуклеотидного состава.

ДНК зонд метится флюоресцентными красителями и одлюминисцентным микроскопом дает характерное зеленое свечение.

Сущность метода:

1. получение ДНК-хромосом клеток или их фрагментов,
2. образец, полученная ДНК обрабатывается щелочью, для образования однонитевых ДНК,
3. обработка однонитевых ДНК, ДНК зондами,
4. ДНК зонды присоединяются к комплементарным участкам однонитевых цепей ДНК,
5. под люминисцентным микроскопом ДНК-зонды дают свечение и указывают на искомый фрагмент ДНК или ген.

Метод широко применяется для изучения локализации генов, в хромосомах человека, картирование хромосом человека, сложные перестройки хромосом, диагностики хромосом, болезней. С экспресс методом диагностики хромосомной патологии относятся и традиционные методы: кариотипирование – подсчет числа хромосом и определение полового хроматина.

1. У человека берут соскоп буккального эпителия,
2. . Смесь клеток размазывают на предметном стекле,
3. Окрашивают,
4. В ядрах определяют тельце Бара.

Близнецовый метод. этот метод заключается в изучении закономерностей наследования признаков в парах одно- и двуяйцевых близнецов.

Суть метода заключается в сравнении проявления признака в разных группах близнецов при учете сходства или различия их генотипов. Монозиготные близнецы, развивающиеся из одной оплодотворенной яйцеклетки, генетически идентичны, так как имеют 100% общих генов.

Поэтому среди монозиготных близнецов наблюдается высокий процент конкордантных пар, в которых признак развивается у обоих близнецов. Сравнение монозиготных близнецов, воспитывающихся в разных условиях постэмбрионального периода, позволяет выявить признаки, в формировании которых существенная роль принадлежит факторам среды.

По этим признакам между близнецами наблюдается дискордантность, т.е. различия.

Существенным моментом при использовании этого метода является статистическая обработка получаемых данных.

Этим методом можно рассчитать частоту встречаемости в популяции различных аллелей гена и разных генотипов по этим аллелям, выяснить распространение в ней различных наследственных признаков, в том числе заболеваний.

При статистической обработке материала, получаемого при обследовании группы населения по интересующему исследователя признаку, основой для выяснения генетической структуры популяции является закон генетического равновесия Харди — Вайнберга.

Цитогенетический метод основан на микроскопическом изучении хромосом в клетках человека.

методом дифференциальногоокрашивания хромосом, который расширил -возможности цитогенетического анализа, позволив точно идентифицировать хромосомы по характеру распределения в них окрашиваемых сегментов.

Биохимический метод. Дефекты ферментов устанавливают путем определения содержания в крови и моче продуктов метаболизма, являющихся результатом функционирования данного белка. Дефицит конечного продукта, сопровождающийся накоплением промежуточных и побочных продуктов нарушенного метаболизма, свидетельствует о дефекте фермента или его дефиците в организме

Биохимическую диагностику наследственных нарушений обмена проводят в два этапа. На первом этапе отбирают предположительные случаи заболеваний, на втором —более точными и сложными методами уточняют диагноз заболевания.

Применение биохимических исследований для диагностики заболеваний в пренатальном периоде или непосредственно после рождения позволяет своевременно выявить патологию и начать специфические медицинские мероприятия, как, например, в случае фенилкетонурии.

Для определения содержания в крови, моче или амниотической жидкости промежуточных, побочных и конечных продуктов обмена кроме качественных реакций со специфическими реактивами на определенные вещества используют хроматографические методы исследования аминокислот и других соединений.

Основные результаты исследования генома человека. Карты хромосом человека.

Проведения генетических тестов, которые могут показать предрасположенность к различным заболеваниям, включая рак груди, нарушения свёртываемости крови, кистозный фиброз, заболевания печени и многим другим.

Также ожидается, что информация о геноме человека поможет поиску причин возникновения рака, болезни Альцгеймера и другим областям клинического значения и, вероятно, в будущем может привести к значительным успехам в их лечении.

Генетические карты хромосом — это схема взаимного расположения и относительных расстояний между генами определенных хромосом, находящихся в одной группе сцепления.

Генетические карты человека используются в медицине при диагностике ряда тяжелых наследственных заболеваний человека. В исследованиях эволюционного процесса сравнивают генетических карты разных видов живых организмов.

Методы –ДНК диагностики. Использование в медицинских и фармакологических исследованиях.

Таким образом, в течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить 50 млрд. идентичных молекул.

Такое количество копий фрагмента ДНК становится видимым в УФ после проведения электрофореза в агарозном геле.

Методы ДНК-диагностики включают в себя такие методы, как ПЦР (полимеразная цепная реакция) и ЛЦР (лигазная цепная реакция). Для исследования методом ПЦР может быть забран практически любой материал. На анализ берут по особой методике соскоб из мочеиспускательного канала, влагалища и шейки матки. Также материалом для ПЦР могут служить кровь, моча, мокрота и т. п.

В ходе различных манипуляций, ДНК инфекции (если она присутствует в забранном материале) многократно удваивается, пока количество ДНК не станет равным 10 8 — 10 12 штук.

Это количество ДНК становится заметным для оборудования, которое проводит диагностику.

Таким образом, ПЦР позволяет обнаружить даже одного возбудителя, даже часть возбудителя в пробирке: если хоть один кусочек ДНК вредоносной инфекции есть, он будет «размножен».

Молекулярно-генетический метод

Молекулярно-генетический  метод основан на анализе нуклеиновых кислот, в первую очередь, молекул ДНК.

Основной целью этих методов является диагностика мутаций, исследование их ассоциации с наследственными заболеваниями, а также выявление  гетерозиготных и гомозиготных носителей мутации.

По-существу, молекулярная диагностика является наиболее объективным методом верификации наследственных заболеваний.

Внедрению молекулярно-генетической методологии в клиническую практику способствовала разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) или специфической амплификации ДНК, произошедшая более 20 лет назад. Первооткрыватель этого метода Керри Мулис за свое изобретение был удостоен Нобелевской премии в 1993 году.

Метод ПЦР  позволяет тестировать состояния генов у отдельных индивидуумов. Его суть заключается в избирательном копировании in vitro небольшого фрагмента гена, в котором предположительно может быть локализована мутация, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК обследуемого.

Небольшие размеры копируемого (или амплифицируемого) фрагмента гена в сочетании с их огромным числом позволяют в дальнейшем использовать очень простые методы для анализа этого участка ДНК, выявления его особенностей у обследуемого пациента.

Главными из этих методов являются электрофорез амплифицированной ДНК, ее окрашивание, разрезание специфическими ферментами – рестриктазами, и определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента — секвенирование.

ПЦР лежит в основе ДНК-диагностики любых наследственных заболеваний. Данный подход широко используется и для анализа генетических факторов риска, предрасполагающих к развитию широко распространенных мультифакториальных заболеваний.

В случае молекулярной диагностики инфекций амплифицируется фрагмент ДНК, специфичный для определенного возбудителя, а затем с помощью электрофореза и окрашивания на ДНК тестируется наличие этого фрагмента, а значит и самого возбудителя, в том биологическом образце, который был взят для анализа.

Использование ПЦР в судебной медицине основано на  амплификации высоко изменчивых областей генома, позволяющих проводить идентификацию личности – метод геномной дактилоскопии.

Это методы выделения ДНК, ПЦР, электрофорез, рестрикция ДНК, гибридизация со специфическими ДНК-зондами и секвенирование. Таким образом, в пределах одной лаборатории можно заниматься ДНК- диагностикой широкого спектра заболеваний.

Остановимся более подробно на ключевых методах молекулярной диагностики.

Выделение ДНК. Прежде всего, необходимо помнить, что основная масса ДНК находится в ядрах в составе хромосом в суперскрученном состоянии за счет взаимодействия с определенными белками. Таким образом, ДНК можно выделять из любого типа тканей или клеток, в которых содержатся ядра. Существует много модификаций методов выделения ДНК.

Мы разберем только принципиальные основы одного из этих методов. У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для чего производят забор из вены от 1 до 5 мл  крови. Кровь нужно собирать в присутствии антикоагулянтов. После отстаивания крови отбирают слой, обогащенный лейкоцитами, и добавляют детергенты для разрушения мембраны клеток.

С помощью мягкого центрифугирования осаждают ядра на дно пробирки. Сливают надосадочную жидкость, и к суспензии ядер добавляют детергенты, разрушающие их мембраны, а также протеолитические ферменты, разрушающие белки. Чаще всего используют протеиназу К. Таким образом ДНК выходит в раствор.

На следующем этапе необходимо отделить фракцию высокомолекулярных ДНК от низкомолекулярных соединений, таких как фрагменты белков, липиды, углеводы и т.п. Одним из способов такого разделения является экстракция фенолом.

При добавлении фенола и тщательном перемешивании низкомолекулярные соединения перейдут в фенол, который окрасится при этом в бурый цвет за счет присутствия фрагментов гемоглобина, а молекулы ДНК останутся на поверхности фенола, так как не смогут войти в этот плотный раствор.

Светлый раствор над фенолом, содержащий ДНК, отбирают и проводят несколько раундов повторных очисток фенолом с добавлением  на последних этапах хлороформа.  Затем можно осадить ДНК из раствора, добавляя этанол. При 700 спирта ДНК выпадает в осадок в виде аморфного образования. В таком состоянии ее можно длительно хранить при  низких температурах.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) илиспецифическая амплификация ДНКэто избирательный синтез in vitro большого количества копий (порядка миллиона) небольшого фрагмента ДНК размером, обычно, в сотни нуклеотидов по матричной молекуле ДНК.

Для проведения ПЦР необходимо искусственно синтезировать небольшие однонитевые молекулы ДНК размером от 15 до 30 нуклеотидов, комплементарные концам амплифицируемого фрагмента ДНК. Эти молекулы носят название праймеры. Они служат «затравкой» для синтеза ДНК и потому определяют его специфичность.

В этот объем определенного буфера добавляют матричную ДНК (ДНК обследуемого), два типа искусственно синтезированных на коммерческой основе праймеров, фермент комплементарного синтеза ДНК – термофильную ДНК-полимеразу,  выделенную из термофильных бактерий и потому способную выдерживать высокие температуры, и 4 типа дезокситрифосфатов (dNTP), которые служат в качестве строительного материала для синтеза ДНК.

На первом этапе матричную ДНК переводят в однонитевую форму путем нагревания раствора выше 950 в течение нескольких минут.

Затем начинают циклически чередовать три кратковременные процедуры, длящиеся несколько десятков секунд:

1. отжиг или посадка праймеров — это происходит при охлаждении раствора до температуры, оптимальной для образования двунитевой структуры матричной ДНК с праймерами;
2. синтез ДНК, начиная с праймера – это происходит при повышении температуры раствора до значений, оптимальных для работы термофильной ДНК-полимеразы
3. ) денатурация синтезированной ДНК – достигается повышением температуры раствора свыше 900 для перехода ДНК в однонитевую форму.

Затем все повторяют, начиная с процедуры (1). Таким образом, при каждом цикле смены температур, происходит удвоение участка ДНК, расположенного между праймерами, причем длина этого участка в точности соответствует расстоянию между внешними концами праймеров.

После проведения 25-30 подобных циклов количество вновь синтезированных фрагментов ДНК достигает или даже превышает  миллион копий. Выбор программы смены температур и длительности каждой из процедур цикла, наряду с выбором праймеров и буфера, зависят от длины и специфики амплифицируемого фрагмента ДНК.

Эти параметры и определяют искусство проведения ПЦР, и очень часто они подбираются эмпирически. Циклическая смена температур производится автоматически в приборе, который называется амплификатор ДНК или термоциклер. Таким образом, ПЦР простой в исполнении, не дорогостоящий, высокоточный  и современный метод молекулярной диагностики.

Электрофорез ДНК принципиально не отличается от белкового электрофореза. Амплифицированную ДНК наносят на полиакриломидный или агарозный гель и включают ток. При этом начинается продвижение ДНК в геле от минуса к плюсу, и скорость этого продвижения зависит от длины молекулы и ее конфигурации.

Через определенное время молекулы ДНК одинаковой длины сконцентрируются в узких зонах. Количество копий синтезированных в процессе проведения ПЦР ДНК, обычно, бывает достаточным для ее визуализации при использовании рутинного метода окрашивания ДНК этидиумом бромидом.

При добавлении этого красителя к гелю полосы ДНК высвечиваются красным цветом при просмотре геля под ультрафиолетовой лампой.

Существует много модификаций ПЦР, удобных для проведения специфических исследований. Так, одномоментно можно амплифицировать не один, а несколько фрагментов ДНК – мультиплексная или множественная ПЦР. Асимметричная  ПЦР  позволяет вести преимущественный синтез одной цепи ДНК.

Вводя специфические красители в праймеры можно оценивать количество копий амплифицированных фрагментов ДНК на автоматическом сканере – количественная ПЦР. Очень мощным является метод ПЦР в реальном времени.

Последний метод, основанный на мультиплексной амплификации повторяющихся хромосом-специфических полиморфных последовательностей ДНК, позволяет оценить количество копий специфических хромосом или их фрагментов, и он  очень удобен для проведения  пренатальной диагностики анеуплоидий у плода, таких как синдром Дауна, Эдвардса, Патау и др.

Молекулярная диагностика мутаций или ДНК-диагностика. Клинические методы молекулярной диагностики зависят от характера повреждения гена, то есть от типа мутации. Наиболее просто диагностируются структурные внутригенные мутации – делеции и инсерции, так как они изменяют длину, а значит, и электрофоретическую подвижность амплифицируемого фрагмента ДНК.

Для диагностики таких мутаций достаточно провести ПЦР с использованием специфических праймеров и  электрофорез, а затем сопоставить длину амплифицированного фрагмента ДНК в норме и у больного. У гомозигот по делеции размер амплифицированного фрагмента будет короче на величину делеции, а значит, этот фрагмент при электрофорезе будет двигаться быстрее и расположится ниже нормального.

У гетерозигот на электрофореграмме будут два фрагмента – один нормальной величины и другой более короткий. Аналогично диагностируются инсерции, только длина амплифицированного фрагмента у мутантных гомозигот будет больше, а сам фрагмент на электрофореграмме будет располагаться выше нормального.

У гетерозигот на электрофореграмме также будут два фрагмента – нормальной величины и длинный, то есть расположенный выше нормального.

Для диагностики более протяженных внутригенных делеций удобным является метод мультиплексной ПЦР с последующим электрофоретическим разделением маплифицированных фрагментов ДНК.

Молекулярная диагностика точковых мутаций миссенс- или нонсенс-типа  более сложна, так как длина амплифицированного фрагмента при этом не меняется. Наиболее распространенным методом диагностики таких мутаций является метод рестрикционного анализа.

Этот метод может быть использован только в тех случаях, когда мутации случайным образом изменяют последовательности, специфичные для узнавания рестриктазами — эндонуклеазами, катализирующими разрезание двунитевых последовательностей ДНК в местах локализации этих специфических сайтов.

При наличии в норме сайта рестрикции произойдет разрезание амплифицированного фрагмента и на электрофореграмме будет две полосы, соответствующие фрагментам ДНК, суммарная длина которых равна величине  исходного амплифицированного фрагмента.

Исчезновение сайта рестрикции в результате мутации приведет к тому, что у мутантных гомозигот разрезания амплифицированного фрагмента не произойдет и на электрофореграмме будет одна полоса, причем характер ее расположения будет аналогичен тому, который можно наблюдать после электрофореза до рестрикции.

У гетерозигот выявятся все три полосы, одна из которых соответствует неразрезанному амплифицированному фрагменту, а две – продуктам рестрикции. В настоящее время идентифицировано более 500 различных рестриктаз, и для каждого из этих ферментов существует свой сайт узнавания.

Поэтому, как только описывается какая-то новая мутация, сразу же с помощью определенной компьютерной технологии производится анализ окружающей ее нуклеотидной последовательности на предмет выявления сайтов рестрикции.

Если этот поиск оказывается успешным, клиническая диагностика подобной мутации проводится методом рестрикционного анализа с использованием специфичной для данного сайта эндонуклеазы. Поскольку метод рестрикционного анализа очень прост и удобен в исполнении, существует много модификаций этого метода, направленных на искусственное введение сайтов рестрикции и т.п. Однако на них мы останавливаться не будем.

Универсальным методом диагностики точковых мутаций является метод аллель-специфических олигонуклеотидов (АСО). Этот метод основан на гибридизации амплифицированных ДНК со специфическими олигонуклеотидными ДНК-зондами. Он более трудоемок, так как требует синтеза и специфического мечения ДНК-зондов.

Однако этот метод поддается автоматизации, и на его базе разрабатываются технологии, позволяющие одновременно тестировать десятки или даже сотни мутаций.

При этом используются микрочиповые технологии, то есть меченные олигонуклеотиды в микроколичестве наносятся на твердые носители (чипы), а затем проводится их гибридизация с исследуемыми образцами ДНК.

Секвенирование ДНКявляется самым объективным методом регистрации мутаций, при котором точно идентифицируется молекулярный характер повреждения. Однако в клинической практике этот метод используются редко в виду его трудоемкости и высокой стоимости.

Молекулярно-генетические методы диагностика наследственных заболеваний

Методы ДНК-технологии используют для выяснения локализации в той или иной хромосоме мутантного гена, ответственного за происхождение определённых форм наследственной патологии.

Так как ген представляет собой участок ДНК, а мутация генов — повреждение первичной структуры ДНК (под мутацией понимают все изменения в последовательности ДНК, независимо от их локализации и влияния на жизнеспособность индивида), то, зондируя препараты метафазных хромосом больного с наследственным заболеванием, удаётся установить локализацию патологического гена. Методы молекулярной генетики создают возможности для диагностики болезней на уровне изменённой структуры ДНК, они позволяют выяснять локализацию наследственных нарушений. Молекулярно-генетические методы могут выявить мутации, связанные с заменой даже одного-единственного основания.

Важнейший этап идентификации гена — его выделение. ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра.

Этапы выделения ДНК включают: быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекул ДНК путём преципитации в этаноле.

В генетических лабораториях ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для чего у пациента забирают 5-20 мл венозной крови в стерильную пробирку с раствором антикоагулянта (гепарин). Затем отделяют лейкоциты и проводят их обработку по изложенным выше этапам.

Следующий этап подготовки материала к исследованию — «разрезание» ДНК на фрагменты в участках со строго специфической последовательностью оснований, которое осуществляют с помощью бактериальных ферментов — рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз).

Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4-6, реже 8-12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разделяют её на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции.

В настоящее время известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, и каждый из этих ферментов узнаёт свою специфическую последовательность нуклеотидов. В дальнейшем сайты рестрикции могут быть использованы в качестве генетических маркёров ДНК.

Образовавшиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путём электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, а тем самым может быть определена их молекулярная масса. Обычно для выявления ДНК в геле используется специфическое окрашивание (чаще бромидом этидия) и просмотр геля в проходящем свете ультрафиолетовой области спектра.

Места локализации ДНК имеют красную окраску. Однако у человека при обработке ДНК несколькими рестриктазами образуется так много фрагментов различной длины, что их не удаётся разделить с помощью электрофореза, то есть не удаётся визуально идентифицировать отдельные фрагменты ДНК на электрофореграмме (получают равномерное окрашивание по всей длине геля). Поэтому для идентификации нужных фрагментов ДНК в таком геле используют метод гибридизации с мечеными ДНК-зондами.

Любой одноцепочечный сегмент ДНК или РНК способен связываться (гибридизироваться) с комплементарной ему цепью, причём гуанин всегда связывается с цитозином, аденин с тимином. Так происходит образование двухцепочечной молекулы.

Если одноцепочечную копию клонированного гена пометить радиоактивной меткой, получится зонд. Зонд способен отыскивать комплементарный сегмент ДНК, который затем легко идентифицировать с помощью радиоавтографии.

Радиоактивный зонд, добавленный к препарату растянутых хромосом, позволяет локализовать ген на определённой хромосоме: с помощью ДНК-зонда можно идентифицировать определённые участки при саузерн-блоттинге. Гибридизация происходит, если тестируемый участок ДНК содержит нормальный ген.

В случае, когда присутствует ненормальная последовательность нуклеотидов, то есть соответствующие структуры хромосомы содержат мутантный ген, гибридизация не произойдёт, что позволяет определить локализацию патологического гена.

Сущность метода состоит в том, что фрагмент ДНК, соответствующий какому-либо гену или участку гена, встраивают в клонирующую частицу, как правило, бактериальную плазмиду (кольцевая внехромосомная ДНК, присутствующая в клетках бактерий и несущая гены устойчивости к антибиотикам), и затем бактерии, имеющие плазмиду со встроенным человеческим геном, размножают. Благодаря процессам синтеза в плазмиде удаётся получить миллиарды копий человеческого гена или его участка.

В дальнейшем полученные копии ДНК, меченные радиоактивной меткой или флюорохромами, используют в качестве зондов для поиска комплементарных последовательностей среди исследуемого пула молекул ДНК.

В настоящее время существует множество разновидностей методов с использованием ДНК-зондов для диагностики генных мутаций.

Молекулярно-генетические методы исследований

Молекулярно-генетические методы исследований стали достижением биологической науки второй половины XX ст. Они позволяют изучить саму структуру ДНК, определить сходства и отличия ДНК разных организмов, их участков, найти повреждения в структуре ДНК и даже расшифровать первичную последователь­ность оснований в ДНК или РНК.

Молекулярно-генетические исследования — это разнообразные методы и методики. Общим для всех их является, во-первых, выделение образца ДНК исследуемого организма и, во-вторых, использование генно-инженерных технологий.

Для получения ДНК берут любые клетки, которые содержат ядра.

Чаще всего у человека — это лейкоциты крови, клетки слизистой оболочки рта (для их получения достаточно легко провести шпателем по внутрен­ней поверхности щеки) или, если изучается геном эмбриона, — околоплодная жидкость.

Преимущество молекулярно-генетических методов в том, что для их проведения необходимо совсем незначительное количество материала. Изучить ДНК организма можно по одному единственному волосу, ничтожному мазку крови, малюсенькому кусочку кожи или кости.

Для проведения молекулярно-генетических исследований почти всегда используют только небольшой фрагмент ДНК, содержащий интересующие гены.

Для получения такого фраг­мента применяют специальные ферменты рестриктазы (от лат. рестрикций — ограничение). Их особенностью является то,что они режут молекулу ДНК в строго определённом месте.

Используя наборы разных рестриктаз, удаётся вырезать из молекулы ДНК нужные фрагменты небольшого размера.

В живом организме амплификация — естественный процесс репликации ДНК, а в лабораторных условиях его подменяет специальная методика — полимеразная цепная реакция (ПЦР). Полученная ДНК является материалом для исследований.

Современные молекулярно-генетические методы позволяют с наивысшей точностью установить родственные отношения двух особей, в том числе и давно умерших людей, если доступны их биологические материалы (кости, волосы).

Суть методики проста: сравнивая определённые участки ДНК разных людей, определяют степень сходства последовательности нуклеоти­дов этих участков. Именно так были идентифицированы члены погибшей семьи последнего российского императора Николая II.

Молекулярно-генетические методы, благодаря их большой точности, используют в судебной медицине, например, метод «генетических отпечатков пальцев».

Из минимального количества биологического материала, найденного на месте преступления (крови, слюны, волос, спермы), выделяют ДНК и расщепляют её на фрагменты. Эти фрагменты разделяют в специальных носителях, получая картинку расположения полос, которую и называют генетическими отпечатками пальцев.

Она уникальна для каждого человека, совпадая только у однояйцевых близ­нецов. Ведь каждый человек по нюансам нуклеотидных последователь­ностей, как и по папиллярным узорам, уникален.

«Генетические отпечатки пальцев» вносят в специальную базу и точно так же, как настоящие отпе­чатки пальцев сравнивают с «генетическими отпечатками пальцев» подо­зреваемого. Этот метод также позволяет установить отцовство — у роди­телей и детей отпечатки в определённой степени похожи.

Молекулярно-генетические методы исследования и их применение в медицине

Молекулярно-генетические методы исследования и их применение в
медицине.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (М-Г)

Молекулярно-генетические методы — большая и  разнообразная группа методов, предназначенна для выявления вариаций (повреждений)  вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (М-Г)

В основе м-г методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК.

Источником  геномной ДНК могут  быть любые ядросодержащие клетки.

Материал для ДНК-диагностики

На практике чаще используют:

• лейкоциты
• хорион
• амниотические клетки
• культуры фибробластов
• волосы, ногти, слюна

Возможность проведения молекулярно-генетического  анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов данной группы.

Материал для ДНК-диагностики

Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости  от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК.

Для этого требуется действительно небольшое количество биологического материала:

• 20-40 мг хориона,
• 1 мл крови,
• 5-10 мг культуры клеток

Материал для ДНК-диагностики

Для осуществления определенных методов достаточно:

• 1 капли крови
• соскоба эпителия со щеки
• несколько волосяных луковиц и т.д.

Методическое преимущество м-г анализа

Небольшое  количество легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом  методов молекулярно- генетического анализа

Выделенная  ДНК одинаково пригодна для проведения различных вариантов методов и может долго сохраняться в замороженном виде.

Исходные условия для проведения м-г методов

• Оснащение молекулярно-генетической лаборатории
• Специальная подготовка материала исследования в соответствующих лабораториях
• Получение образцов ДНК (или РНК) — исходный этап всех методов.

Этот этап реализуется в двух вариантах:

• а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток;
• б) накопление определенных фрагментов, которые предполагается анализировать с помощью полимеразной цепной реакции.

Рестрикция

Рестрикция  ДНК на фрагменты является необходимым  этапом в молекулярно-генетической диагностике.

Этот процесс осуществляется #рестриктазами#, относящимся к группе бактериальных эндонуклеаз.

В генетике человека используется несколько десятков разных рестриктаз.

Рестриктазы

Основное  свойство рестриктаз — разрывать двухцепочечную ДНК в пределах строго определенных для каждого фрагмента последовательностях нуклеотидов протяженностью 4-6 пар оснований (редко больше).

При обработке  геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины.

Электрофорез фрагментов ДНК

Электрофорез  фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля.

• Фрагменты ДНК движутся в геле,
• помещенном в постоянное электрическое поле,
• от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле).

После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля.

Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.

Наследственные болезни: методы прямой диагностики мутаций

   Прямая диагностика мутаций включает несколько методов:

• определение нуклеотидной последовательности (секвенирование);
• выявление нарушения места рестрикции;
• аллельспецифическую гибридизацию с синтетическими олигонуклеотидными зондами;
• химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах неправильного сшивания оснований;
• регистрацию изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК;
• трансляцию белкового продукта in vitro.

Метод нуклеотидной последовательности

Непосредственная диагностика патологических мутаций путем определения нуклеотидной последовательности является наиболее точным методом. Позволяет достоверно выявлять:

• замены оснований,
• делеции
• вставки на всем протяжении изучаемого фрагмента.

Метод нуклеотидной последовательности

• трудоемкость секвенирования
• высокая стоимость , что частично ограничивает применение этого варианта прямой детекции мутаций.

Перспективы: развитие автоматизации секвенирования позволяет надеяться, что в будущем этот метод займет ведущее место в диагностике наследственной патологии.

Метод выявления мутаций по нарушению рестрикции

• Выявление нарушения места рестрикции осуществляется с помощью блот-гибридизации по Саузерну .
• При обработке соответствующей рестриктазой в геле отсутствуют фрагмент ДНК, выявляемый у нормальных индивидов.
• Примерно 50% нуклеотидных замен приводит к изменению места (или сайта) рестрикции, благодаря чему возможна прямая детекция мутаций на основе рестриктного анализа.

Метод выявления мутаций гибридизацией с зондом

• Аллельспецифическая гибридизация с олигонуклеотидными зондами позволяет обнаруживать мутации в геномной ДНК
• Последовательность оснований в олигонуклеотидном зонде может быть задана по нормальному или патологическому варианту гена, затем помечена
•  И  в том, и в другом случае  такой зонд используется для гибридизации с фрагментом ДНК обследуемого индивида.

Метод выявления мутаций по расщеплению ДНК

• Химическое (или ферментативное) расщепление  ДНК в местах неправильной сшивки оснований выявляет большую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК.
• Мутации в молекуле ДНК  могут изменять электрофоретическую  подвижность фрагмента  ДНК.

Метод выявления мутаций по расщеплению ДНК

• Во-первых, могут изменяться температурные показатели плавления двухцепочечных фрагментов, что можно определить с помощью электрофореза двухцепочечной ДНК в градиентном денатурирующем геле (так называемый денатурирующий гель-электрофорез).
• Во-вторых, в результате мутации изменяться конформация одноцепочных фрагментов, что выявляется путем электрофореза предварительно денатурирующих ДНК в неденатурирующих условиях
• В-третьих, проводиться так называемый гетеродуплексный анализ, с помощью которого обнаруживаются нарушения линейности гетеродуплексов в местах коротких вставок и делеций

Суть этого варианта электрофорез ДНК в нейтральном  или равномерно денатурирующем геле

Метод выявления мутаций по трансляции белков

Трансляция  белкового продукта осуществляется в системе in vitro на основе полученной специфической мРНК с добавлением лизата ретикулоцитов (в нем содержатся все необходимые компоненты для синтеза белка).

В этой системе синтезируется белковый продукт соответствующего гена.

Молекулярно-генетические исследования

Генетическая предрасположенность к тому или иному заболеванию очень часто ведет к развитию тяжелых и необратимых форм болезни. Своевременно полученные знания о персональных генетических особенностях каждого организма могут позволить в значительной степени снизить риск развития патологии и принять адекватные действия в сторону профилактики и полного излечения.

Выявить генетическую предрасположенность к тем или иным наследственным, мультифакторным и другим заболеваниям позволяют молекулярно-генетические исследования, отражающие врожденные генетические особенности каждого человека. Они дают полное представление о клинической картине пациента и позволяют выявлять нарушения в отдельных генах (это мутации) — в клинической практике анализируются наиболее распространенные мутации.

Молекулярно-генетические исследования позволяют

• подобрать индивидуальную дозу целого ряда лекарственных препаратов и за счет этого сократить риск побочных эффектов;
• предпринять адекватные действия в сторону снижения скорости развития заболевания;
• в случае заболевания определить ведущее патогенетическое звено и прогнозировать течение всего процесса заболевания и излечения.

Выделить ДНК (дезоксирибонуклеиновую кислоту) — она может быть выделена из различного биологического материала, крайне важного для исследования:

• крови (анализ крови с ЭДТА) — предпочтительно!
• эпителия с внутренней поверхности щек (буккального эпителия, получаемого с помощью мазка).

Что немаловажно, ДНК одинакова во всех клетках человека и остается неизменной на протяжении всей жизни. Поэтому многие молекулярно-генетические исследования достаточно пройти только раз при согласовании с лечащим врачом.

В качестве результата проведенного молекулярно-генетического исследования вы получите

1. Табличную форму с комментариями специалиста.
2. Заключение по результатам тестирования.
3. Рекомендации по дополнительным исследованиям.
4. Практические рекомендации.

Клиника «Евромедпрестиж» работает с несколькими пакетами молекулярно-генетических исследований

Для определения генетической предрасположенности к различным заболеваниям:

• развернутое генетическое обследование для женщин
• развернутое генетическое обследования для мужчин
• скрининг
• предрасположенность к ожирению и диабету
• риск атеросклероза и ишемической болезни сердца, предрасположенность к дислипидемии (нарушению обмена веществ с повышением уровня холестерина в крови)
• риск нарушений системы свертывания в крови
• дефекты ферментов фолатного цикла, ведущего к развитию различных трудно поддающихся диагностике и лечению патологий (особенно патологий обмена веществ, беременности и т.д.)
• предрасположенность к гипертонии
• предрасположенность к бронхиальной астме
• генетическая обусловленность силы воспалительной реакции
• риск развития рака молочной железы
• предрасположенность к остеопорозу
• наследственная лактозная непереносимость
• предрасположенность к парадонтозу

При фармагенетике:

• чувствительность к некоторым фармацевтическим средствам (варфарину, плавиксу)
• фармакогенетика антиагрегантных препаратов.